凭据靶基因能够设想多对gRNA,差别的gRNA介导的Cas9对DNA的切割效力不一致,因而正在应用CRISPR-Cas9竖立基因敲除或敲入植物前需求先对gRNA停止活性考证,拔取可以或许介导更高切割效力的gRNA。泓迅科技能够供应三种gRNA活性检测要领: SSA活性检测、体外切割活性考证和内源性活性切割。

SSA活性检测

单链复性(Single-strand annealing,SSA)检测,能够考证打靶质粒是不是具有切割袒露DNA的才能,是开端评价CRISPR-Cas9体系有活性的一种常用的要领。正在SSA报导质粒中含有两个不具有活性的荧光素酶(luciferase)编码片断,正在二者中央含有一个停止密码子和一段gRNA的靶序列。当CRISPR-Cas9能对靶序列停止有用切割构成DNA单链断裂(Double strand breaks,DSBs),细胞经由过程SSA机制对DNA序列停止同源重组修复,从而从新构成有活性的荧光素酶基因,以后经由过程荧光检测便能够展望CRISPR-Cas9的切割活性。

ssa讲演质粒构建

SSA讲演质粒构建

SSA活性检测效果

SSA活性检测效果

 

 

 

 

 

 

 

 

配套产物:SSA活性报导质粒构建试剂盒(货号:k0001)

体外切割活性考证

CRISPR-Cas9体系的剪切活性取sgRNA靶点辨认序列相干。每一个sgRNA靶点辨认差别,剪切活性也有所差别,因而需求挑选出切割效力最高的sgRNA。体外检测sgRNA活性检测:运用Cas9体外酶切靶点DNA序列,得到的两条DNA片断。经由过程琼脂糖电泳剖析,视察gRNA介导的DNA被切割的百分比,从而判定gRNA的活性和切割效力。

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配套产物:gRNA靶点体外切割活性检测试剂盒(货号:k0002)

内源活性检测

Surveyor 法即错配内切酶检测法,接纳T7E1内切酶。正在靶点两侧设想适宜的引物,PCR扩增出露有错配突变位点的DNA条带。T7E1内切酶能够辨认并切割错配的纯合DNA双链。将酶切产品经由过程琼脂糖电泳剖析能够初度预计切割条带取已切割条带的比例,从而回响反映出CRISPR-Cas9的活性。

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活性检测服务内容详情:

服务称号 产物/服务内容 托付周期 托付项目 价钱
SSA活性检测 1.gRNA靶点引物设想取分解
2.pSSA-luc载体构建
3.细胞转染
征询 检测讲演 征询
体外切割活性考证 1.体外转录gRNA
2.CRISPR-Cas9体外酶切回响反映
征询 检测讲演 征询
内源活性检测 1.基因组提取
2.靶点引物设想
3.T7E1酶切回响反映
征询 检测讲演 征询

 

差别活性检测服务项目区分:

服务项目 区分
SSA活性检测 设想简朴、操纵轻易、经济有用。
体外切割活性检测 只需靶点设想,便可停止考证;无需细胞平台支撑,EP管内就能实现,本钱较昂贵。
内源活性检测 挑选周期短,可加速考证流程。

 

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