密码子优化

密码子优化,指的是应用偏幸密码子(Preferred codons),即制止利用率低的有数密码子,简化基因转录后mRNA的二级构造,去除不利于高效表达的模体(Motif),到场有利于高效表达的模体,调解GC含量等这些要领从新设想基因。基因分解的商业化大大鞭策了密码子优化的适用范围和影响力。

基因的最优表达是经由过程对基因自己、载体、宿主体系、造就前提的系统性设想实现的。一般科研工作者通例存眷要点是挑选适宜的表达载体和宿主体系,而每每无视基因自己是不是取载体和宿主体系到达最好婚配。泓迅应用多年的分解生物学履历,对基因和载体的设想优化我们存眷以下几个主要方面:

1. 密码子偏好性

差别物种对同义密码子的运用频次是差别的,而这类密码子偏好性对翻译历程有影响。若是一条mRNA有许多成簇的有数密码子,那会对核糖体的活动速度形成负面影响,大大低落卵白表达程度。如果正在基因的同义密码子运用频次取表达宿主相婚配的状况下,卵白的表达程度则会明显进步。婚配水平常用密码子顺应指数 (Codon Adaption Index)去示意,一般状况下,CAI≥0.80被以为是展望重组卵白高效表达的尺度。

除密码子的偏好性中,借需求思索密码子的组合运用效力。亦即,正在大部分状况下,仅用高频密码子的结果其实不会最好,考虑到高频和次高频密码子的组合运用结果会更佳。泓迅具有自主知识产权的NGCodon优化软件是业内正在那方面的创始。

2. mRNA二级构造

mRNA二级构造是影响翻译历程的另外一主要身分,庞大稳固的二级构造会障碍翻译历程的顺利进行,特别是核糖体绑定位点 (RBS)四周的二级构造。mRNA二级构造正在DNA序列中重要显示为发卡构造(Hairpin),有用辨认并尽量的削减发卡构造是密码子优化软件好坏的主要判定尺度。上面是应用NG™Codon优化软件针对二级构造优化的一个典范案例。

Hairpins Analysis Optimized Wildtype
Small Hairpins 4 5
Medium Hairpins 0 3
Large Hairpins 0 0

3. 影响表达的反式感化元件和限制性酶切位点的去除

优化历程不只需求考虑到对翻译有主动影响的元件/序列,借需求考虑到对转录和翻译有悲观影响的元件/序列。任何关于转录和翻译有悲观感化的反式感化元件需求经由过程密码子优化软件去除以消弭转录和翻译历程中的多重停滞。

限制性酶切位点需求凭据克隆战略停止个性化扫除,以避免酶切位点发生抵触,影响构建表达载体的操纵。

4. GC含量

AT间存在2个氢键,GC间存在3个氢键,以是GC含量间接影响着DNA序列的联合稳定性和退火温度。正在启动子等守旧地区GC含量相对较下。别的,GC含量也影响着mRNA热力学稳定性及mRNA二级构造。

5. 翻译肇端取停止效力

卵白稳定性、mRNA稳定性和翻译效力对卵白产量和可溶性起重要感化。翻译历程分为肇端、延长和停止三个期。

起首,肇端阶段的顺利进行决意了卵白表达量从无到有。关于翻译的肇端,本核mRNA需求5’端非翻译前导序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特异核糖体联合序列。正在真核细胞,有用的肇端依赖于盘绕正在肇端密码子ATG上下流的一段叫Kozak序列的序列。

高效的延长阶段决意了蛋白质可以或许积聚的量。这个在前面的密码子偏好性及二级构造和反式感化元件等篇章曾经具体议论过。

翻译停止是卵白生命周期必需的一步,却最轻易被疏忽。科学研究注解停止效力对卵白表达程度有很大的影响,更有用的翻译停止会增进卵白表达。绝大多数生物皆有偏幸的盘绕停止密码子的序列框架,比方酵母和哺乳动物偏幸的停止密码子分别是UAA和UGA,单子叶植物最常应用UGA,而虫豸和大肠杆菌倾向于用UAA。

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