运用CRISPR-Cas9体系对细菌基因停止可编程性的抑止和激活

【配景】

CRIPSR-Cas9体系是一种有用、便利的基因组编纂手艺,经由过程sgRNA介导突变后不具有切割活性的Cas9核酸酶(dCas9),联合特定的DNA序列位点,能够抑止或激活细菌的基因表达。现在,很多研讨中需求准确天调治基因表达,而不单单是让基因功用完整损失,也能够增进大概抑止基因表达,因而dCas9手艺激活或抑止基因表达的研讨也遭到了极大的存眷,科研人员以为工资掌握基因的转录关于基因功用的研讨和基因网络的构建具有重要意义。

【要领】

  1. 构建dCas9质粒体系(图1),对Cas9基因10位点和840位点停止突变,使其落空对DNA单链的切割活性。dCas9卵白联合到靶基因的转录肇端位点,阻挠RNA聚合酶的联合,从而到达抑止转录肇端和转录延长的感化;
  2.  构建dCas9质粒抑止基因表达

  3. 构建了一系列取目的序列不婚配的crRNA(图2),经由过程对crRNA 5’末尾停止突变,构成 8个差别碱基突变的crRNA,将其转入到细胞中检测对基因表达形成的影响;
  4. 设想取目的序列具有不婚配碱基的crRNA

  5. 将ω亚基和dCas9的C-和N-终端融会链接起来,能够正在启动子的上游稳固的联合RNA聚合酶从而增进激活转录(图3),并凭据启动子序列的差别位置设想了4个差别的crRNA,用来掌握lacZ基因的表达(图4);
  6. 针对启动子上游地区差别位点设想4个crRNA(Z1-Z4)

  7. 正在-35启动子地区差别位置设想了10个crRNA,经由过程掌握gfp-mut2基因的启动子调治基因表达(图5)。
  8. 正在gfp-mut2基因的启动子上游地区差别位点设想10个crRNA(W101-W110)

【结论】

  1. 为了评价和检测dCas9对启动子表达和转录延长的抑止结果,构建GFP讲演载体。效果显现,正在启动子的-35和-10地区,dCas9削减了凌驾100倍的荧光,由此阐明,dCas9靶定启动子区后,可以或许抑止启动子表达,编码地区和非编码地区皆视察到了荧光的削弱,阐明dCas9联合基因组后可以或许阻挠RNA聚合酶的联合(图6);
  2. dCas9对启动子表达的抑止结果和对转录延长的抑止结果

  3. 不完全婚配的crRNA也能够调治dCas9的抑止表达程度,3’末尾12个互补的dCas9序列(即8个不婚配序列)转录抑止的结果最强(图7);
  4. 差别婚配水平的crRNA也能够调治dCas9的抑止表达程度

  5. 同时检测了差别crRNA介导Cas9对DNA切割的才能,效果显现关于差别的crRNA来讲,差别婚配度的crRNA对DNA切割形成的影响也是差别的(图8);
  6. 差别的crRNA介导Cas9对DNA切割的才能

  7. crRNA联合的位点取lac基因表达具有肯定的相关性(图9),Z4位置的crRNA的激活结果最好,具有2.8倍的激活率。然则,其实不是所有的位点都能够增进基因表达,若是过于靠近启动子位点,则可能会抑止基因表达;
  8. 差别的crRNA取lac基因表达的相关性

  9. 10个差别crRNA中,W103和W108 crRNA可以或许强效激活gfp-mut2基因表达(图10);
  10. 启动子上游地区差别位置的crRNA荧光表达量程度

  11. 运用W103和W108对gfp-mut2基因的三个变体停止激活测试能够得知,差别的启动子介导dCas9能够使基因过表达,表达量取启动子的范例具有肯定的相关性(图11)。
  12. W103和W108 crRNA对gfp-mut2基因的三个变体停止激活状况

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参考文献
Bikard, D., et al., Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res,2013. 41(15): p. 7429-37.