由dCas9介导的高效的转录激活体系
【配景】

CRISPR-Cas9手艺能够正确、高效的对基因组特定靶位点停止基因编纂,形成基因的缺失大概插入。不具有切割活性的dCas9仍旧能够正在sgRNA的介导下正确的靶向基因组DNA,因而设想将dCas9取转录加强子停止融会,希冀获得的融会卵白可对基因转录具有增效的结果。这种方法为研讨基因的转录激活调控供应了新的要领。

【要领】

dCas9载体构建计划,后续可融会转录激活因子增进转录的停止(图1)。
dCas9载体构建

【结论】

  1. dCas9取转录激活因子融会转录加强效果显现,融会三个转录激活因子的加强的结果显着高于融会单个转录激活因子(图2);
  2. 融会转录激活因子后的表达状况

  3. 为了肯定VPR构成的必要性,将三个转录因子中的差别局部用mcherry交换。效果显现,被mcherry交换后的转录加强结果不明显(图3),由此阐明VRP构造构成关于转录激活具有重要作用;
  4. VPR构造构成对加强结果的影响

  5. VPR衔接递次是转录激活的影响因子,当递次为VP64-p65-Rta时,转录激活结果最显着(图4);
  6. VPR的衔接递次对加强结果的影响

  7. 检测人类293T细胞中的MIAT、NEUROD1、ASCL1、RHOXF2、TTN、ACTC1基因,效果显现dCas9联合转录加强子对差别的基因激活水平差别(图5);
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  9. dCas9-VPR正在差别的物种中转录激活效应有所差异,从7倍到 32,600倍的激活效应(图6)。
  10. dCas9-VPR正在差别的物种中的转录激活效应

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参考文献
Chavez, A., et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods, 2015. 12(4): p. 326-8.

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