应用CRISPRi手艺调控基因表达

【配景】

CRISPRi手艺是正在CRISPR-Cas9基础上,将Cas9卵白革新成为不具有切割活性的dCas9,正在sgRNA的介导下仍能够靶向基因组序列。CRISPRi手艺可以或许有用的抑止编码基因和非编码基因的表达,并可同时对多个基因停止调控且无脱靶率。CRISPRi手艺的泛起为研讨基因的功用供应了高效的新方法。

【要领】

设想dCas9构造包孕两个突变体RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三个局部:20nt用于取婚配目的序列,42nt用于取Cas9联合,40nt为转录停止构造。针对mRFP基因编码序列差别地区设想sgRNA,用于检测dCas9可否高效抑止基因表达。

dCas9取sgRNA设计方案

【结论】

  1. CRISPRi手艺可以或许抑止转录肇端和延长,靶向非模板链DNA的dCas9-sgRNA会发生有用的缄默沉静;靶向模板链DNA的dCas9-sgRNA结果不明显,dCas9-sgRNA构造靶向启动子地区可以或许形成有用的基因缄默沉静(图1);
  2. CRISPRi抑止转录延长历程

  3. CRISPRi基因抑止历程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc启动子掌握,跟着工夫的延伸,mRFP卵白荧光量先降后升,最初会规复到取阳性对比雷同的程度(图2),由此阐明CRISPRi基因敲除是一个可逆的历程;
  4. CRISPRi基因抑止表达历程

  5. 正在目的位点上游转录停息,停息位点取目的位点之间长度为19bp碱基,由此得知CRISPRi经由过程抑止转录历程对基因表达停止调治(图3);
  6. CRIPSRi做用于转录延长历程

  7. CRISPRi sgRNA缄默沉静是下特异性的,对齐基因组范围内的mRNA序列测序得知,sgRNA(NT1)靶向mRFP基因后,mRFP基因是独一转录歉度低落的基因,没有其他基因显现出显着的基因表达量的转变(图4);
  8. CRISPRi sgRNA的缄默沉静是下特异性

  9. CRISPRi可以或许同时调治多个基因,设想两个sgRNA离别靶向mRFP基因和sfGFP基因,CRISPRi体系可将两个基因同时敲除,由此阐明CRISPRi体系能够同时对多基因停止调治(图5);
  10. CRISPRi同时对多个基因调治

  11. 决意CRISPRi缄默沉静效力的身分:sgRNA长度、取目的序列的重合度和sgRNA的位置CRISPRi抑止的结果取目的位点取肇端位点之间的间隔呈反比例相干(图6),一般情况下,sgRNA取基因组序列有20bp反复序列用于靶向目的序列,而经由过程实行数据能够得知基因缄默沉静所需婚配序列的最短长度是12bp(图7);sgRNA的最后7nt碱基地区关于基因缄默沉静具有重要作用(图8);运用两个sgRNA靶向同一个基因,能够进步CRISPRi的效力,然则,若是两个sgRNA具有堆叠效应时,可能会低落CRISPRi的效力(图9);
  12. sgRNA取目的基因组的婚配水平
    单sgRNA取两重sgRNA靶向目的基因的结果

  13. CRISPRi手艺可应用于内源性的基因网络。针对大肠杆菌乳糖表达路子上的相干基因设想sgRNA,效果能够得知,LacZ基因的表达量遭到抑止,而LacI基因则被激活,表达量有所增添(图10)。由此阐明CRISPRi手艺能够供应一个快速、有用的要领去考证基因网络中各个基因的功用;
  14. 大肠杆菌乳糖管理路子上的相干基因表达量

  15. CRISPRi手艺正在人类细胞中也一样实用,可对人类HEK293细胞系中的基因表达形成抑止(图11)。
  16. CRISPRi使人类HEK293细胞内荧光表达量低落

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参考文献
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.