应用CRISPR RNPs下通量平台研讨人类T细胞中HIV病毒的感化功用研讨

【配景】

将体外融会的CRISPR RNPs经由过程电穿孔的要领,对人体的CD4+ T细胞胜利实现基因组编纂。为了相识细胞中HIV病毒和人类宿主细胞之间的相互作用,运用CRISPR RNPs下通量平台实现对宿主细胞中的候选基因高效有序的编纂。运用这类新的基因东西不只能够胜利实现CD4+ T细胞中的基因编纂,同时借能够实现高效的、成对的基因敲除。CRISPR RNPs下通量平台最大的上风是高效、大量、有序的挑选出取某些表型相干的候选基因,该手艺可以或许增进药物靶标确认和细胞程度上HIV病毒感染的医治。

【要领】

  1. 编纂人类T细胞中的HIV病毒的宿主身分
  2. 运用96孔板体外分解差别的Cas9 RNPs重组卵白,并经由过程电穿孔的要领将其转入到人类CD4+细胞中能够正在一个血液样本中快速的发生几百个差别的,转基因润饰池。
    实行流程:从人体血液中纯化出CD4+ T细胞,正在抗CD3/CD28刺激下激活;运用电穿孔法将Cas9 RNPs转入,正在DNA和卵白程度上检测基因组编纂状况;这些被编纂过的细胞群体经由过程多种HIV病毒打针实行去检测功用(图1)。
    运用多重平台正在人类CD+细胞中编纂HIV宿主身分的流程

  3. 确认正在人类低级T细胞中的HIV候选依靠身分
  4. 敲除取HIV整合相干的LEDGF基因,设想,6个crRNA用于检测并确认LEDGF基因敲除对人类T细胞的影响。为了有更显着的结果,用别的一种熏染体式格局运用效力最高的crRNA对人类低级T细胞停止熏染(图2)。
    对人类低级T细胞停止病毒感染

【结论】

  1. 正在DNA程度和卵白程度证明了Cas9 RNPs胜利的对细胞的基因组停止了润饰;
  2. 运用Cas9 RNPs下通量平台去高效正确的敲除CXCR4和CCR5基因;
  3. 6个crRNA对LEDGF基因敲除效果显现(图3和图4),个中两个crRNA能够使卵白表达显着低落,运用其他熏染体式格局对细胞停止熏染后发明,3天后细胞内病毒的复制有2~7倍的低落;7天后,结果越发显着,细胞内病毒复制有6~12倍的低落;
  4. LEDGF基因卵白表达量
    LEDGF基因卵白表达量

  5. TNPO3基因和LEDGF基因敲除后,细胞能够制止病毒感染(图5)。由此能够证实TNPO3基因和LEDGF基因是HIV病毒的依靠身分;
  6. TNPO3基因和LEDGF基因表达量

  7. 零丁运用Cas9 RNPs敲除CXCR4基因和CD4+基因取同时敲除两个基因,二者间基因编纂效力没有差异(图6);
  8. CXCR4基因取CD4+基因的基因编纂效力

  9. 同时运用Cas9 RNPs对CXCR4和LEDGF基因停止敲除,效果显现零丁敲除CXCR4和LEDGF基因大概成对敲除两个基因之间的效力是雷同的(图7)。由此阐明,Cas9 RNPs多重编纂平台能够高效的一站式对成对的基因停止敲除,取零丁敲除要领比拟效力稳定;
  10. CXCR4和LEDGF基因停止敲除效力

  11. 运用CRISPR-Cas9 RNPs下通量平台能够对人类T细胞体系停止挑选及下通量表型剖析,因而对已宣布的文献中提到的45个间接大概直接取HIV整合酶相干的基因停止挑选。针对45个基因设想了146个sgRNA,造就48 h工夫后运用HIV病毒感染,2~6天后视察效果发明,CXCR4、CDK9、LEDGF、GEMIN2、KPNA1、KPNA5、KAT2A、FAM96B、UNC45A基因敲除后能够抑止HIV病毒的熏染。而SMARCB1、XRCC6基因的敲除致使HIV病毒感染的加强;PLOD1、SUCLA2、HDGFRP2、EEEF1A1四个基因最少正在一个个别中成为HIV病毒感染的潜伏身分(图8)。
  12. 下通量平台对人类T细胞体系的停止挑选及表型剖析效果

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参考文献

Hultquist, J.F., et al., A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Rep, 2016.17(5): p. 1438-52.