运用CRISPR-Cas9手艺对人类T细胞停止编纂

【配景】

T细胞作为人体主要的免疫细胞,对人体的免疫调节起到主要的感化,若是可以或许对T细胞的基因组胜利停止编纂,那么对癌症、HIV、免疫缺点疾病和自身免疫病医治则能够从细胞程度停止医治。现在,CRISPR-Cas9基因编纂手艺能够对多种细胞范例的基因组停止编纂,然则关于人类的T细胞另有肯定难度,尤其是对T细胞的基因组停止交换性的基因润饰。本文经由过程优化CRISPR-Cas9手艺,预先将Cas9卵白取sgRNA正在体外组装成Cas9 RNPs,再将Cas9 RNPs转入到细胞中对基因组停止敲除/敲入。本文胜利天完成了对人类CD4+ T细胞中的HIV病毒的配合受体CXCR4卵白和免疫抑制卵白PD-1的基因靶点的编纂,经由准确编纂后的人体CD4+ T细胞数目获得增添,因而无望于应用于人体的免疫医治中。这类基于CRISPR RNPs的基因治疗要领,能够工资的对自然的T细胞停止特异性革新,为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的医治带了新的要领和思绪。

【要领】

  1. 运用电穿孔的要领将Cas9 RNPs导入到细胞内,敲除人类CD4+ T细胞外面CXCR4基因的外显子地区(图1);
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  3. 针对CXCR4基因设想单链DNA模板用于同源重组修复(图2),交换本序列中的12个碱基,并到场Hind III酶切位点用于考证目的序列是不是交换胜利;
  4. 凭据CXCR4基因设想HDR模板

  5. 针对PD-1基因的第一个外显子设想单链DNA模板,交换本序列的12个碱基,并引入了Hind III酶切位点用于后续考证(图3)。
  6. 凭据PD-1基因设想HDR模板

【结论】

  1. 经由T7E1要领肯定Cas9 RNPs能够胜利编纂T细胞基因组中的CXCR4基因,从而也对人类CD4+ T细胞中的卵白表达形成影响。同时,流式细胞仪可以或许雄厚被编纂过的T细胞的数目,为Cas9 RNP应用于T细胞供应一种有用的东西;
  2. 经由Hind III酶考证要领得知,基因敲入的目的序列被Hind III酶切割构成2条新的短序列,由此阐明Cas9 RNPs联合HDR模板能够准确天对人类T细胞中CXCR4基因和PD-1基因停止交换性的基因润饰(图4和5);
  3. CXCR4基因润饰后Hind III酶切后凝胶电泳结

  4. 经由过程体外组装Cas9 RNPs能够实现对人类CD4+ T细胞有用的基因组编纂,包孕对人类CD4+T细胞中CXCR4和PD-1的基因润饰。

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参考文献

  1. Schumann, K., et al., Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(33): p. 10437-42.