哺乳动物细胞CRISPR-Cas9的基因编纂

【配景】

靶向核酸酶以其高效性成为了介导基因组编纂的壮大东西。现在,世界上运用最普遍的基因编纂东西是从细菌的免疫系统中星散出来的CRISPR-Cas9体系。它是经由过程sgRNA介导Cas9核酸内切酶对基因组特定的20nt序列停止剪切,并经由过程非同源末尾修复(NHEJ)或同源定向修复(HDR)去实现基因的敲除或敲入(knock-out/in) ,从而对哺乳动物细胞内或革新细胞株的下流功用停止研讨。同时为了最大水平的削减脱靶效力,接纳了单切口战略,运用成对的sgRNA介导Cas9核酸内切酶。CRIPSR-Cas9 手艺周期短,从靶点设想最先,能够正在短至1-2周内实现基因润饰,而且能够正在2-3周内获得润饰过的克隆细胞系。CRISPR-Cas9手艺可对哺乳动物基因的停止高效准确的敲除和敲入,可普遍应用于基因功用的后续考证事情中。

【要领】

  1. sgRNA的设计方案
  2. 推荐运用CRISPR设想东西(http://tools.genome-engineering.org)去停止靶位点的挑选(图1);
    sgRNA设计方案

  3. 构建sgRNA和Cas9表达载体
  4. 凭据设计方案构建sgRNA和Cas9载体,同时正在Cas9载体中增加GFP或嘌呤霉素抗性基因以资助后续挑选转染细胞。离别构建了CRISPR-Cas9的单载体体系和单载体体系(图2);
    构建sgRNA和Cas9表达载体

  5. 构建修复模版
  6. 为了实现基因的敲入,需求构建同源模板。同源模板由需求敲入的基因和靶位点两侧的序列构成的两同源臂组成。一般状况下,修复模板为载体的情势,单侧的同源臂长度要凌驾500bp;为单链DNA的情势时,单侧的同源臂长度最少要40bp(图3);
    构建修复模版

  7. 功用考证
  8. 功用考证的要领包孕Surveyor错配内切酶检测法、HindIII酶切位点法及测序要领(图4)。Surveyor错配酶能够对异源双链停止切割,并经由过程凝胶条带的强度去肯定切割DNA的分数,从而盘算Cas9的切割效力(Indel百分比)(图2);正在插入的目的基因中插入了HindIII酶切位点可对PCR产品停止切割,一样经由过程凝胶条带的强度去盘算Cas9的切割效力(图3)。
    功用考证

【结论】

  1. 设想两个sgRNA同时对人类HEK293FT细胞中的DYRK1A和GRIN2B基因停止敲除,每个位点敲除效力为65~68%(图5),证实了CRISPR-Cas9可以或许轻便且高效的应用于哺乳动物基因组;
  2. 哺乳动物基因编纂

  3. 成对的sgRNA对EMX1基因外显子停止敲除,可对基因形成细小准确的编纂结果(图6);
  4. EMX1基因外显子敲除效力

  5. 基因敲入时设想的修复模板既能够是质粒也能够是单链的DNA(ssODN),基因敲入效力最低为0.18%,最高也不过是27%。由此能够得知,基因敲入的效力要近低于基因敲除的效力(图7)
  6. 运用质粒和ssOND修复的基因敲入效力

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参考文献
Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 2013. 8(11): p. 2281-308.