运用no-SCAR体系完成大肠杆菌的基因组编纂

【配景】

CRISPR-Cas9作为一种运用普遍的基因组编纂手艺可对各物种的基因组停止高效、正确的润饰。Cas9核酸内切酶能够形成DNA单链断裂,经由过程同源重组和非同源末尾衔接两种路子对基因组停止修复,实现基因组碱基的缺失或插入,终究完成精准的基因润饰。正在大肠杆菌细胞中需求λ-Red体系完成断裂基因组的修复,因而no-SCAR(Scarless Cas9 Assisted Recombineering)体系运用λ-Red要领增进基因组重组中源DNA和Cas9介导的单链DNA切割对野生型细胞停止挑选,同时质粒体系无需染色体符号。这类no-SCAR体系能够对基因组的多个位点停止点突变、基因删除和短序列的插入,可以或许高效、无痕的一步完成,为微生物基因组研讨供应了快速、有用的要领。

【要领】

Cas9质粒体系包含PTET启动子,掌握Cas9基因表达的ssrA标签和增添背调治表达的tetR启动子,能够严格控制Cas9质粒的转录。sgRNA质粒体系包含gam、bet、exo基因,这些基因表达的λ-Red重组体系能够资助大肠杆菌基因组停止重组。两个质粒体系包含基因组润饰所需的所有元件,无宿主特异性(图1)。

Cas9及sgRNA质粒体系构成

【结论】

  1. 构建的Cas9和sgRNA表达质粒包含了大肠杆菌基因组润饰的所有元件,无宿主特异性,可对基因组任何位点停止点突变、基因组敲除/敲入;
  2. ropB基因516位点的错义点突变对利福平药物发生抗药性(图2);
  3. RopB基因位点突变序列

  4. 应用71bp长度的引物胜利删除了ack基因的1,095bp长度的序列(图3)
  5. ack基因删除序列

  6. 正在pfkA基因中胜利插入79bp长度的ssA标签(图4);
  7. pfkA基因插入序列

  8. 将细胞离别正在根基培养基和无氯霉素培养基上37℃留宿造就后,克隆细胞只正在根基培养基上发展。由此阐明,no-SCAR质粒能够正在基因组编纂完成后被移除,不会对后续基因组编纂操纵形成影响。

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参考文献

Reisch, C.R. and K.L. Prather, The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli. Sci Rep, 2015(5) :p. 15096.

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