基因敲除要领挑选取人类肿瘤发展和抗药性相干的基因

【配景】

现在,RNAi手艺是挑选哺乳动物细胞基因组功用缺失的一种重要要领。然则RNAi手艺只能经由过程降解mRNA的要领到达抑止基因表达的结果,没法正在基因组程度经由过程敲除基因形成功用缺失。CRISPR-Cas9手艺经由过程sgRNA介导Cas9卵白,对哺乳动物基因组的特定位点发生插入/缺失的突变,形成其基因功用永久性缺失,有较好的抑止结果。因而构建缓病毒包装的CRISPR-Cas9的下通量挑选文库能够实现基因组范围内的大规模功用基因的挑选。CRISPR-Cas9下通量挑选文库可普遍应用于人类肿瘤疾病研讨中,体系的剖析、考证一些取肿瘤发展及抗药性相干基因,挑选取肿瘤疾病医治相干的药物靶点。

【要领】

  1. 构建单质粒载体(图1),载体包含了Cas9基因、sgRNA基因和Puro挑选符号,运用缓病毒包装转染细胞(图2);
  2. 缓病毒包装单质粒表达载体

  3. 针对人类基因组中18,080个基因的5’外显子,均匀每一个基因设想3~4个sgRNA位点,构建含有64,751个sgRNA的文库(图2);
  4. sgRNA文库构建及缓病毒包装

  5. 为了检测GeCKO文库的敲除结果,接纳阴性挑选检测取细胞耐药性相干的基因;接纳阳性挑选检测取细胞发展或生计相干的基因。
    下通量挑选效果的前期剖析接纳RIGER算法(图3)。
  6. CRISPR基因敲除文库挑选及收集、剖析具有挑选表型的细胞

【结论】

  1. 阴性挑选效果显现,GeCKO文库挑选到某些取核糖体构造构成的相干的基因对黑色素瘤A375细胞的发展具有主要的感化;
  2. 阳性挑选效果显现,除已知的NF1和MED12基因,NF2、CUL3、TADA1和TADA2B那4个基因也到场了威罗菲尼正在黑色素瘤A375细胞中的耐药调治历程。

CRISPR-Cas9服务订购

  1. Email:请将您的具体需求发送到support@synbio-tech.com
  2. 电话订购:您能够间接拨打免费热线4000-973-630转803www.6556.cc经验丰富的工程师
  3. QQ征询:任何手艺题目都可取我们在线互动,泓迅科技官方企业QQ:4000-973-630
  4. 存眷泓迅科技微疑民众号:szhxswkj;根据“姓名+黉舍/公司名称+www.6556.cc”给我们留言,便可免费获得“CRISPR-Cas9基因编纂手艺运用手册”。

参考文献

  1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7