lentiCRISPR体系载体改进及GeCKO文库用于功用基因组文库挑选

【配景】

正在人类和小鼠细胞中CRISPR-Cas9齐基因组文库曾经替换了RNAi手艺,成为一种新的挑选体式格局,而且这类手艺正在多种生物模子中被用于展现新的机制。然则最后的由病毒包装的CRISPR齐基因组敲除(GeCKO)文库病毒效价较低大概需求细胞系表达Cas9,限定了生物体系合适挑选的局限。因而,改进CRISPR载体体系及GeCKO文库关于生物齐基因组功用挑选的运用具有主要的意义。本文供应了改进载体和GeCKO文库的多种要领,并停止的周密的考证,得到了改进的单质粒体系和下覆盖率和下天真度的GeCKO文库。

【要领】

  1. 构建了新的lentiCRISPRV2体系:去除了传统的lentiCRISPRV1NLS序列,对盈余的NLS序列和P2A顺反子序列停止密码子优化并对U6启动子位置停止调解;
  2. 构建了单载体体系,离别表达Cas9和sgRNA的lentiCas9-Blast和lentiGuide-Puro(图1);
  3. 单质粒载体体系和单质粒载体体系的构建

  4. 改进GeCKO文库:正在特异性剖析的基础上进步脱靶分数从而低落脱靶效力,突变pre-miRNA的发卡构造去抑止miRNA正在转录历程中的感化,增添了1,000个基因的sgRNA;
  5. 改进GeCKO文库分红两个亚文库,每一个亚文库包孕3个sgRNA和1,000个对比sgRNA。

【结论】

  1. 单载体的lentiCRISPRV2体系比lentiCRISPRV1的病毒滴度高10倍;单载体的lentiGuide-Puro体系比lentiCRISPRV1下100倍(图2);
  2. 联合的亚文库对齐基因组停止挑选能够进步文库覆盖率,而单个亚文库能够针对细胞数目较少的齐基因组停止挑选,如原代细胞、体内扫描等。这类亚文库能够针对细胞数量的多少,更天真的对细胞的齐基因组停止挑选。
  3. 差别的载体体系病毒滴度对照

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参考文献

  1. Sanjana, N.E., O. Shalem and F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 783-4.
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